CONCLUSION FINAL DE LA UNIDAD NUMERO 4

 

En esta unidad numero 4 de la asignatura de biologia molecular llamada replicacion del ADN puedo decir abiertamente que no preste atencion a las clases, me perdi desde un principio y despues cuando quise agarrarle ya no pude comprender lo que el profesor enseño y aclaro que lo hiso muy bien, solo que simplemente no se me dio, no lo entendi, no preste atencion ni interes, la calificacion que saque en el examen es fiel reflejo a lo que les acabo de decir. Al decir esto aclaro tambien que el no haber entendido no es por que haya sido dificil o complicada la unidad, viendolo bien, el examen que hisimos correspondiente a dicha unidad fue de los mas faciles que hacemos hasta el momento, al momento de contestar el examen no podia creer como las preguntas eran muy sencillas, y solo por no haber estudiado y prestado atencion lo iba a reprobar. Lo unico que le entendi y comprendi fue las diferencias que existen entre la replicacion en eucarites y en procariotes, y cuales son algunas de las enzimas que intervienen en dicha replicacion. Espero para la proxima unidad hecharle mas ganas desde un principio, en esta unidad me descuide feo, pero para las proximas quiero cumplir con mi objetivo que me plantie al iniciar el curso de biologia molecular, que es no reprobar.

4.4 REPLICACION IN VITRO DEL ADN (PCR)

Gracias a la PCR un fragmento de ADN se puede replicar “in vitro” de forma muy rápida. Para esta técnica se requiere:
- sintetizar los “iniciadores”: son pequeños segmentos monocatenarios de ADN complementarios a cada uno de los extremos 3´ del fragmento de ADN que se quiere replicar; esto requiere conocer la secuencia de nucleótidos de ese fragmento
- la presencia de una ADN-POLIMERASA que resista temperaturas de 100ºC; ésta se obtiene a partir de una bacteria que vive en aguas termales
Para la reacción, se introducen en una disolución que contiene la enzima ADNPOLIMERASA, el fragmento de ADN a replicar, se añaden los nucleótidos que forman parte del ADN y los “iniciadores” sintetizados. Esta disolución se introduce en un aparato que varía la temperatura en ciclos: primero sube la T a 100ºC para que se separen las cadenas del fragmento de ADN (desnaturalización); a continuación, baja la T para permitir que los” iniciadores“ se unan a cada cadena de ADN, y para que la ADN-POLIMERASA añada nuevos nucleótidos a cada “iniciador”; se forman así 2 fragmentos de ADN idénticos al inicial (replicación).
A continuación, se inicia otro ciclo: sube la T a 100ºC, produciéndose la desnaturalización de los fragmentos obtenidos; baja la T y se produce la replicación de cada cadena, lo que origina 4 nuevos fragmentos de ADN. Al repetirse otro ciclo, se originarán 8 fragmentos de ADN y así sucesivamente. Cada ciclo dura unos 5´y con unos 20 a 30 ciclos se dispone de suficientes copias del fragmento inicial.

 

 

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio que permite la copia in vitro de secuencias específicas de DNA y que ha revolucionado el campo de la Biología Molecular. Conceptualmente, la PCR es una técnica sencilla, consiste en la separación por calor de las dos cadenas del DNA que se quiere amplificar, y su copia simultánea a partir de un punto, determinado por un fragmento de DNA artificial llamado cebador, mediante la acción de una enzima denominada DNA polimerasa. El resultado es la duplicación del número de moléculas de una secuencia concreta de DNA. Este proceso se repite un número determinado de veces o ciclos, generalmente 30, y se consigue un aumento o amplificación exponencial del número de copias del fragmento de DNA molde. Por tanto, si partimos de una molécula única de DNA en la muestra inicial, y en cada ciclo se duplica el número de moléculas, teóricamente, al final de los 30 ciclos, se obtendrán 2³⁰ moléculas idénticas, es decir 1073741824 moléculas.

 

La gran ventaja de la PCR es que amplifica únicamente el fragmento de DNA que queremos aunque esté en cantidades mínimas (alta sensibilidad) o en presencia de grandes cantidades de otros DNA semejantes (alta especificidad). La reacción es eficaz incluso si se parte de muestras de DNA muy poco purificadas, en presencia de otros componentes.

La PCR mejoró vertiginosamente como herramienta de laboratorio a partir de 1988, gracias a dos hechos que hicieron que la técnica se pudiera automatizar: el primero de ellos fue la comercialización de la enzima denominada Taq polimerasa (Saiki et al, 1988) que es un enzima termoestable, por lo que permanece activa después de incubaciones prolongadas a 94 ºC, y no hay que añadirla en cada ciclo de amplificación. El segundo hecho fue la aparición en el mercado de los primeros termocicladores que realizaban los cambios de temperatura automáticamente, sin necesidad de distintos baños. La gran revolución que ha producido en la Biología Molecular la aparición de la PCR ha supuesto para su descubridor la concesión del Premio Nobel  en el año 1993.

Así, la PCR se ha convertido en una herramienta fundamental en campos tan diversos como la investigación (clonado de genes, detección de clones recombinantes, estudio de DNA de fósiles), medicina forense y criminalística (determinación de la paternidad, identificación de individuos, identificación sospechoso/evidencia en casos de asesinato, violación, etc.), sanidad animal y mejora genética (detección de enfermedades genéticas e infecciosas, pureza de razas, etc.) y medicina (diagnóstico de enfermedades). La PCR fue desarrollada por Kary Mullis (Saiki et al, 1985; Mullis, 1990) en 1985, utilizando como DNA polimerasa el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I de E. coli y lo llevó a cabo cambiando los tubos de reacción en cada ciclo, entre dos baños que estaban a 94 ºC (desnaturalización) y 37 ºC (hibridación y extensión del cebador). Debido a que esta enzima se desnaturaliza a temperaturas superiores a 37 ºC, era necesario añadirla en cada uno de los ciclos tras el paso de desnaturalización, lo que convertía a la PCR en una técnica tediosa y costosa.

 BIBLIOGRAFIA

 http://www.elergonomista.com/biologiaselectividad/sb26.html

 bioserv.fiu.edu/~biolab/.../dna%20processes.htm 

4.4.1 SECUENCIACION DEL ADN

 Consiste en determinar el orden exacto de los pares de bases en un segmento de ADN.

El ADN consta de una cadena lineal compuesta por cuatro bases que se representan con las letras: G, A, T y C. El orden en que estas bases se disponen es lo que codifica la información fundamental en el material genético de un organismo.

La secuenciación de ADN es el proceso por el cual se establece el orden preciso de bases a lo largo de una cadena de ADN. Esto se hace comúnmente al someter los fragmentos de ADN a electroforesis en gel, lo cual lleva a la separación del ADN en fragmentos que difieren en tamaño sólo por una base. Cada fragmento de ADN se detecta debido a la presencia de un marcador radioactivo o fluorescente. Los instrumentos usados más comúnmente para establecer las secuencias del ADN emplean ahora un rayo láser para detectar el ADN marcado fluorescente. A partir del patrón de los fragmentos de ADN resultantes se puede deducir la secuencia subyacente del ADN. 

 

La introducción de métodos rápidos de secuenciación a finales de los años 70 representó un cambio importante en los estudios sobre el DNA Existen TRES métodos de secuenciación de los ácidos nucleicos. Uno de ellos (Maxam y Gilbert) utiliza reactivos químicos a fin de cortar el DNA a nivel de bases específicas. El otro se denomina enzimático, de terminación en cadena o didesoxi (Sanger, Nicklen y Coulson). Y actualmente el metodod automatizado con lectores laser de capilaridad. El fin de ambos es conseguir la secuencia completa de cada una de las bases que constituyen un fragmento de ácido nucleico.

En el método químico un fragmento de DNA se marca en uno de sus extremos con P o S radiactivo por acción de la enzima polinucleótido quinasa. Ambos extremos se separan por la acción de una enzima de restriccion. El paso siguiente consiste en romper estos fragmentos, no más de una o dos veces por molécula, con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases. Haremos cuatro alícuotas y trataremos cada una de ellas con un compuesto químico que modifique una de las cuatro bases, aproximadamente una vez por molécula de DNA. El tratamiento posterior con piperidina producirá la rotura de la cadena allí donde la base había sido alterada.

 Método enzimático de terminación de cadena o método didesoxi de Sanger

Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por el método enzimático de terminación de cadena, se necesitan los siguientes compuestos:

El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar. Para poder secuenciar un segmento de ADN, previamente se necesita tener gran cantidad de ese fragmento, y por tanto, hay que clonarlo en un vector apropiado. Además, debe estar en estado de hélice sencilla.

Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Polimerasa I del bacteriofago T4. La ADN Polimersa I del fago T4 emplea como molde ADN de hélice sencilla y siguiendo las reglas de complementaridad de las bases nitrogenadas va añadiendo nucleótidos a partir de un cebador o "primer".

Un cebador o "primer" que suele ser un oligonucleótido corto de alrededor de 20 bases de longitud necesario para que la ADN polimerasa I comience a añadir nucleótidos por el extremo 3' OH. Este cebador debe poseer una secuencia de bases complementaria a la del fragmento de ADN que se desea secuenciar. Debido a que la secuencia de nucleótidos del segmento que se quiere secuenciar es desconocida, se emplea un "primer"  con secuencia complementaria al vector empleado para clonar el fragmento de ADN, además, este cebador procede de una región del vector muy cercana al punto de inserción del ADN problema  cuya secuencia se conoce. El "primer" utilizado suele marcarse radiactivamente.

Los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de marcar radiactivamente el cebador, se marca radiactivamente uno de los cuatro nucleótidos trifosfato en cada reacción.

 Por último, se necesitan nucleótidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los nucleótidos didesoxi son nucleótidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la posición 3' de la desoxirribosa. 

 

La principal diferencia entre método enzimático de terminación de cadena y el método automático de secuenciación radica, en primer lugar en el tipo de marcaje. En el método automático en vez de radiactividad se utiliza fluorescencia y lo habitual es realizar cuatro mezclas de reacción, cada una con nucleótido trifosfato (dTTP) marcado con un fluorocromo distinto. Este sistema permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo los ADNs de nueva síntesis producto de las cuatro mezclas de reacción.

La segunda diferencia radica en el sistema de detección de los fragmentos de ADN. La detección del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reacción se lleva a cabo al mismo tiempo que la electroforesis, de manera que los fragmentos de ADN de menor tamaño que ya han sido detectados se dejan escapar del gel, permitiendo este sistema aumentar el número de nucleótidos que se pueden determinar en cada electroforesis y, por consiguiente, en cada secuenciación.

La secuenciación de ADN se ha convertido en la técnica de referencia para el diagnóstico genético de enfermedades. Inicialmente, la secuenciación de ADN se utilizaba solamente como herramienta de investigación. De esta manera, el uso masivo de estas técnicas permitió describir los primeros genomas completos. Esos primeros genomas se han utilizado como secuencias de referencia.

Hoy en dia, la secuenciación de ADN se emplea como rutina como herremienta para el diagnóstico de las enfermedades genéticas.

 

B IBLIOGRAFIA

http://medicina-genomica.blogspot.mx/2011/04/que-es-la-secuenciacion-de-adn.html

 http://www.conocimientosweb.net/portal/term1573.html