lunes, 11 de junio de 2012



10.2 Técnicas de hibridación. 

la hibridación de acidos nucleicos

 La hibridación es la unión complementaria de ácidos nucléicos (ADN o ARN). Técnicas dehibridación se utilizan a menudo para detectar una molécula diana partiendo de una sondacomplementaria a ella, también se usan habitualmente en el diagnóstico de enfermedades, laidentificación de microorganismos patógenos, el estudio de perfiles de expresión génica, lalocalización de genes en cromosomas o de ARNm en tejidos (hibridación in situ) o en lacomparación de especies hibridando su ADN. Se parte de dos poblaciones de ácidos nucléicos: un conjunto homogéneo de ácidos nucléicos desecuencia conocida que actúa como sonda y otro conjunto heterogéneo de ácidos nucléicos desecuencia desconocida donde queremos detectar la secuencia diana. Una de ellas debe estarmarcada. Si lo está la sonda, la hibridación es estándar. Si lo está la diana, la hibridación esreversa. Los ácidos nucléicos de partida son de cadena sencilla, bien procedentes de ADN clonadoy fragmentado por enzimas de restricción, bien oligonucleótidos sintéticos. Durante la hibridaciónse produce la unión de las moléculas diana con las moléculas sonda. Esta unión depende de lacomplementariedad de bases. Así, aumentando la fuerza iónica (por ejemplo, la concentración decloruro sódico NaCl) o disminuyendo la temperatura se permite la hibridación aunque existanalgunas bases no complementarias. 

 


 
TECNICS DE HIBR IDACION

Hibridación in situ con filtro (HISF).


La Hibridación in situ sobre filtros (FISH) es más rápida que el Dot - Blot ya que no se realiza la extracción de DNA. Es poco específica, pero es útil para estudiar con gran número de muestras. La Hibridación in situ es una técnica relativamente rápida y accesible a los laboratorios de diagnóstico si se utilizan sondas no radiactivas. En este caso, se obtiene una coloración específica en los núcleos positivos, fácilmente observable en un microscopio óptico de rutina.
Esta técnica permite trabajar con pequeños fragmentos de tejidos. Si bien no distingue subtipos ni permite caracterizar nuevos tipos virales, es el único método que hace posible observar en forma conjunta la arquitectura del tejido y la presencia y distribución del DNA viral. Es también de gran utilidad en diagnósticos retrospectivos de muestras histológicas de archivo (27)

 

 
  Hibridación Southern blot (SB). Necesita de la extracción del ADN de la muestra con fenol/cloroformo y de la eliminación de ARN y proteinas de la misma por digestión enzimática. Con la aplicación de endonucleasas de restricción-la enzima Pst I es la mas utilizada, pues corta los genomas de HPVs en fragmentos de diferentes tamaños ofreciendo un patrón característico en el gel de agarosa-el ADN se rompe, realizándose una separación electroforética de los fragmentos en gel de agarosa los cuales pueden ser visualizados con bromuro de etidio. El ADN se desnaturaliza y se transfiere a una membrana realizándose una hibridación. El SB es el método de referencia actual para el tipaje de HPVs. La especificidad de esta técnica es superior a cualquier otra debido a la purificación extra del ADN por electroforesis. Además es el único método que permite conocer si el genoma viral está en situación episomal o integrado en el ADN celular. Las desventajas fundamentales del SB son su gran complejidad técnica, duración de la misma y la necesidad de utilizar tejidos no fijados, puesto que existen protocolos para material fijado, su sensibilidad se reduce muy notablemente.

 

 
El blot invertido (BI) es una variante del SB. El ADN celular es marcado e hibridado con con diferentes DNA-HPVs, previamente digeridos y dispuestos en un filtro. El BI requiere una reacción individual para cada especímen, de sensibilidad inferior al SB (detecta 10 copias HPV/célula), se suele utilizar para tipar muchos genotipos en un espécimen.

 

 El dot/spot blot (DB) consiste en la extracción del ADN celular total y en su desnaturalización, después se fija a una membrana por medio de presión negativa en un aparato manifold. También se puede realizar la desnaturalización en la misma membrana. Una vez realizada la hibridación se produce la autorradigrafía, si se emplearon sondas calientes o el revelado enzimático, si se utilizaron frías. Con el DB se pueden analizar de una vez mas de 100 especímenes mientras que el SB no admite mas de 15. Uno de los problemas mas importantes del DB es el "fondo" provocado por las hibridaciones inespecíficas. Este problema se puede minimizar con el uso de sondas de ARN ya que los híbridos ARN-ADN tienen una Tm superior a los ADN-ADN y las hibridaciones inespecíficas pueden eliminarse con la aplicación de ARNasa (2).  

 

 
La hibridación sandwich (HS) no necesita extracción del ADN. Esta técnica utiliza una sonda con dos fragmentos separados, cada uno con una región complementaria con el ácido nucléico diana. Un fragmento se une al filtro y fija la secuencia específica de HPV al mismo. El segundo de los fragmentos está marcado y se fija al híbrido anclado en la membrana permitiendo su detección.La HS es un método con una especificidad estimada en 1-5 X 105 moléculas de ADN HPV (1 a 5 veces mas que el DB) y muy sensible (3 veces el DB).La HS tiene varios inconvenientes, por una parte solo un tipo de HPV puede ser analizado por muestra, además, para obtener buenos resultados se necesita un volumen importante de muestra, superior a 5 X 105 (3). 

La hibridación Northern se utiliza para la detcción de RNA  de HPVs. El ARN celular se extrae y se separa por medio de un gel desnaturalizante que contiene formaldehido. Seguidamente se hibridan con sondas ARN antisense o ADN.
En todos los sistemas de hibridación descritos anteriormente el ácido nucléico diana está localizado en un soporte sólido, bien una membrana o una biopsia o extendido citológico, en los procedimientos que seguidamente describiremos el ácido nucleico se encuentra disuelto en un líquido.

 

 
Detalle de la tecnica de Southern

Esta técnica fue descrita por el Dr. Southern en 1975 y constituye el método más utilizado para analizar la estructura del ADN cortado por enzimas de restricción. Para la realización de esta técnica se debe extraer ADN genómico de linfocitos de sangre periférica para conocer el genotipo normal del individuo y ADN del tejido tumoral. Con una muestra de 10 cm3 de sangre se pueden extraer de 200 a 300 nanogramos de ADN con lo que se pueden realizar de 20 a 30 "digestiones" con enzimas de restricción.

La técnica de Southern Blotting permite identificar uno o dos fragmentos de ADN de interés en el aparentemente uniforme colección de millón de fragmentos cortados con la enzima de restricción. El siguiente paso consiste en la desnaturalización de los fragmentos de cadena doble para obtener fragmentos de cadena única. Esto se logra con un bufer de Ph básico.

La técnica consiste en cortar el DNA con enzimas de restricción para producirfragmentos de diferente tamaño. Los fragmentos se separan por su tamaño molecular medianteelectroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio (Rybicki y Purves, 1996). Losfragmentos son luego transferidos a una membrana que actúa como filtro. Para ello el gel se sumergeen una solución salina para denaturarlo a hebras sencillas. Las hebras se adhieren al papel secante quelas recibe y acepta debido a sus propiedades químicas. Después los fragmentos se fijan (por UV) alfiltro membranoso y pueden ser hibridados con una sonda que se marque radioactivamente y que tengauna secuencia complementaria a la del fragmento en cuestión. Después de la hibridación, se lava elfiltro y los fragmentos se detectan por radioautografía o mediante fluorescencia (en caso de marcajeno-radioctivo).
 
Southern Blot
 
El Southern Blot es una técnica que permite la identificación de secuencias específicas de DNA,mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridación utilizando sondas especificas.Para analizar una muestra de DNA cromosomal ésta debe ser previamente fragmentada, por ejemploutilizando sonicación ó enzimas de restricción.Los fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor tamaño mediante una electroforesis en gel deagarosa. Una vez terminada la electroforesis y sin teñir el gel, los fragmentos de DNA se traspasan aun filtro de nitrocelulosa ó a una membrana de nylon.A continuación, el filtro se incuba con una sonda marcada, específica para la secuencia que se deseaidentificar. Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, DNAds ó RNAm, que reconocerá a lasecuencia de DNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementariasde ácidos nucleicos.El traspaso de las muestras desde el gel al filtro es una etapa esencial, porque el reconocimiento debases complementarias entre sonda y secuencias de DNA en el gel es muy ineficiente.Cabe señalar que el nombre de la técnica Southern Blot deriva en parte del apellido Southern delinvestigador que la desarrolló y de la palabra en inglés Blot que significa traspasar.
 

 

  
BIBLIOGRAFIA

 
















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