Andrews Biology

9.2.2 QUÍMICOS

Basados en la formación de complejos que las células sean capaces de adquirir e incorporar, bien sea directamente mediante la ruta endocítica (fosfato cálcico, DEAE dextrano) o a las membranas (lipofección).

Actualmente uno de los campos de estudio más importantes por lo que se refiere a les técnicas de transferencia de genes, son los estudios realizados con los llamados vectores sintéticos (también usados en técnicas de terapia génica), con tal de evitar los problemas derivados de la utilización de virus para la transferencia de genes.

Los vectores sintéticos (han tenido una alta eficacia in vitro, pero una baja in vivo) son de producción sencilla, altamente estables, y se pueden conseguir grandes construcciones.

Método del fosfato cálcico:

Basado en la obtención de un precipitado entre el cloruro de calcio y el DNA en una solución salina de fosfatos. En esta situación co-precipitan formando unos agregados que son endocitados/fagocitados por las células. Aparentemente el agregado con calcio protege al DNA de la degradación por las nucleasas celulares. El tamaño y la calidad del precipitado es crítico para el éxito del proceso, que se ve afectado por factores tales como pequeños cambios en el pH de la solución, etc...

La presente invención proporciona un método para la transfección con fosfato de calcio de una célula huésped eucariótica, en donde las partículas que comprenden fosfato de calcio y un ácido nucleico deseado se hacen crecer hasta una tamaño óptimo y a continuación se ponen en contacto con la célula huésped bajo condiciones que reducen sustancialmente la velocidad de crecimiento de la partícula y permiten que la célula huésped absorba las partículas para formar una célula transfectada.

Método del DEAE dextrano:

Basado en la obtención de complejos entre la resina DEAE y el DNA. Los polímeros de DEAE dextrano o polybreno tienen una carga que les permite unirse a las muy negativamente cargadas moléculas de DNA. El DNA acomplejado se introduce en las células mediante choque osmótico mediante DMSO o glicerol. El uso de DEAE dextrano se limita a las transfecciones transientes.

METODO DEL DNA DESNUDO

Consiste en la introducción del DNA en una solución salina o sérica, normalmente mediante inyección intramuscular, para conseguir la expresión del transgén. Se ha observado actualmente expresión en timo, piel, músculo cardíaco y músculo esquelético. No se conoce el mecanismo por el que llega a entrar a la célula aunque se postula que es a través del complejo del poro nuclear.

Tiene un bajo porcentaje de células transfectadas, no hay integración en el genoma y una vez inyectado no hay replicación en el genoma. Este es un sistema utilizado para la realización de la terapia génica "in vivo".

Método Péptidos fusiogénicos:

Los péptidos fusiogénicos surgen en una línea de trabajo que nos permita paliar aquellas características del DNA desnudo que nos impiden la entrada.

Estos péptidos fusiogénicosa se utilizan para compactar DNA. y de este modo adoptan DNA con proteínas ricas en cargas +, del tipos Histonas. Esto supone una condensación considerable, ya que el DNA aparece en la forma de partículas de 50-150 nanometros, pero sólo un cierto grado de condensación permite que 1 transportador incluya 1 molécula de DNA. Asimismo la reducción de tamaño del DNA hasta unos 20 nanometros facilitaría el paso a la célula y hasta el núcleo, incrementando su protección contra las nucleases citoplasmáticas. En el proceso de penetración celular, los transportadores sintéticos (si su carga neta es +) interactuan con Aminoazucares de la Membrana plasmáticacon (carga -) para producir la incorporación a la célula en forma de endosomas. Por tanto tenemos un problema más a superar.

Método de Liposomas:

Los liposomas estan formados por DNA y lípidos no inmunogénicos cargados positivamente lípidos cationicos.

Se empezó a trabajar con lípidos no inmunogénicosados, ya que la organización de los lípidos en bicapa podría facilitar el paso a través de la membrana citoplasmática. Aunque estos lípidos no englobaban mucho DNA.
A raiz de esto se crearon los liposomas que superan el problema de la compactación debido a que el DNA se contornea como consecuencia de las cargas positivas de lípidos (en los liposomas DNA está ocho veces más condensados que en lípidos normales). Además se pretende controlar su destino mediante proteinas en membrana de liposoma. Una característica en común con la anterior es que se forman de forma espontanea si se colocan los dos en un mismo medio.